单细胞转录组基础分析六：伪时间分析

单细胞测序技术是近年最大的生命科学突破之一，相关文章频繁发表于各大顶级期刊，然而单细胞数据的分析依然是大家普遍面临的障碍。本专题将针对10X Genomics单细胞转录组数据演示各种主流分析，包括基于Seurat的基础分析、以及基于clusterProfiler、Monocle、SingleR等R包的延伸分析。不足之处请大家批评指正，欢迎添加Kinesin微信交流探讨！

Monocle进行伪时间分析的核心技术是一种机器学习算法——反向图形嵌入 (Reversed Graph Embedding)。它分析的前提需要一张展现细胞转录特征相似性关系的图，Monocle2使用DDTree降维图，Monocle3使用UMAP降维图。Monocle的机器学习算法可以依据上述降维图形，学习描述细胞如何从一种状态过渡到另一种状态的轨迹。Monocle假设轨迹是树状结构，一端是“根”，另一端是“叶”。一个细胞在生物过程的开始，从根开始沿着主干进行，直到它到达第一个分支。然后，该细胞必须选择一条路径，并沿着树移动越来越远，直到它到达一片叶子。一个细胞的假时间值是它返回根所需的距离。降维方面monocle与seurat的过程大同小异，首先进行数据标准化，其次选择部分基因代表细胞转录特征，最后选用适当的算法降维。对Monocle原理感兴趣的同学可以登录官网查看：

http://cole-trapnell-lab.github.io/monocle-release/

数据导入与处理

轨迹分析的前提是待分析的细胞有紧密的发育关系，PBMC细胞不是很好的的示例数据，我们选择T细胞群体演示一下。Monocle建议导入原始表达矩阵，由它完成数据标准化和其他预处理。

dir.create("pseudotime")
scRNAsub <- readRDS("scRNAsub.rds")  #scRNAsub是上一节保存的T细胞子集seurat对象
data <- as(as.matrix(scRNAsub@assays$RNA@counts), 'sparseMatrix')
pd <- new('AnnotatedDataFrame', data = scRNAsub@meta.data)
fData <- data.frame(gene_short_name = row.names(data), row.names = row.names(data))
fd <- new('AnnotatedDataFrame', data = fData)
mycds <- newCellDataSet(data,
                        phenoData = pd,
                        featureData = fd,
                        expressionFamily = negbinomial.size())

expressionFamily参数用于指定表达矩阵的数据类型，有几个选项可以选择：

稀疏矩阵用negbinomial.size()，
FPKM值用tobit()，
logFPKM值用gaussianff()

mycds是Monocle为我们的数据生成的对象，相当于我们在seurat使用的scRNA对象。数据导入后需要进行标准化和其他预处理：

mycds <- estimateSizeFactors(mycds)
mycds <- estimateDispersions(mycds, cores=4, relative_expr = TRUE)
#mycds <- detectGenes(mycds, min_expr = 2)  #很多教程不用

与seurat把标准化后的表达矩阵保存在对象中不同，monocle只保存一些中间结果在对象中，需要用时再用这些中间结果转化。经过上面三个函数的计算，mycds对象中多了SizeFactors、Dipersions、num_cells_expressed和num_genes_expressed等信息。

提选择代表性基因

完成数据导入和预处理后，就可以考虑选择哪些基因代表细胞的发育特征，Monocle官网教程提供了4个选择方法：

选择发育差异表达基因
选择clusters差异表达基因
选择离散程度高的基因
自定义发育marker基因

前三种都是无监督分析方法，细胞发育轨迹生成完全不受人工干预；最后一种是半监督分析方法，可以使用先验知识辅助分析。第一种方法要求实验设计有不同的时间点，对起点和终点的样本做基因表达差异分析，挑选显著差异的基因进行后续分析。对于没有时序设计的实验样本，可以使用第2、3种方法挑选基因。第2种方法要先对细胞降维聚类，然后用clusters之间差异表达的基因开展后续分析。Monocle有一套自己的降维聚类方法，与seurat的方法大同小异，很多教程直接使用seurat的差异分析结果。第3种方法使用离散程度高的基因开展分析，seurat有挑选高变基因的方法，monocle也有自己选择的算法。本案例数据不具备使用第1、4种方法的条件，因此这里只演示2、3种方法的使用。

##使用clusters差异表达基因
diff.genes <- read.csv('subcluster/diff_genes_wilcox.csv')
diff.genes <- subset(diff.genes,p_val_adj<0.01)$gene
mycds <- setOrderingFilter(mycds, diff.genes)
p1 <- plot_ordering_genes(mycds)
##使用seurat选择的高变基因
var.genes <- VariableFeatures(scRNAsub)
mycds <- setOrderingFilter(mycds, var.genes)
p2 <- plot_ordering_genes(mycds)
##使用monocle选择的高变基因
disp_table <- dispersionTable(mycds)
disp.genes <- subset(disp_table, mean_expression >= 0.1 & dispersion_empirical >= 1 * dispersion_fit)$gene_id
mycds <- setOrderingFilter(mycds, disp.genes)
p3 <- plot_ordering_genes(mycds)
##结果对比
p1|p2|p3

选择不同的基因集，拟时分析的结果不同，实践中可以几种方法都试一下。

降维及细胞排序

使用disp.genes开展后续分析

#降维
mycds <- reduceDimension(mycds, max_components = 2, method = 'DDRTree')
#排序
mycds <- orderCells(mycds)
#State轨迹分布图
plot1 <- plot_cell_trajectory(mycds, color_by = "State")
ggsave("pseudotime/State.pdf", plot = plot1, width = 6, height = 5)
ggsave("pseudotime/State.png", plot = plot1, width = 6, height = 5)
##Cluster轨迹分布图
plot2 <- plot_cell_trajectory(mycds, color_by = "seurat_clusters")
ggsave("pseudotime/Cluster.pdf", plot = plot2, width = 6, height = 5)
ggsave("pseudotime/Cluster.png", plot = plot2, width = 6, height = 5)
##Pseudotime轨迹图
plot3 <- plot_cell_trajectory(mycds, color_by = "Pseudotime")
ggsave("pseudotime/Pseudotime.pdf", plot = plot3, width = 6, height = 5)
ggsave("pseudotime/Pseudotime.png", plot = plot3, width = 6, height = 5)
##合并作图
plotc <- plot1|plot2|plot3
ggsave("pseudotime/Combination.pdf", plot = plotc, width = 10, height = 3.5)
ggsave("pseudotime/Combination.png", plot = plotc, width = 10, height = 3.5)
##保存结果
write.csv(pData(mycds), "pseudotime/pseudotime.csv")

使用diff.genes分析的结果

轨迹图分面显示

p1 <- plot_cell_trajectory(mycds, color_by = "State") + facet_wrap(~State, nrow = 1)
p2 <- plot_cell_trajectory(mycds, color_by = "seurat_clusters") + facet_wrap(~seurat_clusters, nrow = 1)
plotc <- p1/p2
ggsave("pseudotime/trajectory_facet.png", plot = plotc, width = 6, height = 5)

Monocle基因可视化

s.genes <- c("ITGB1","CCR7","KLRB1","GNLY")
p1 <- plot_genes_jitter(mycds[s.genes,], grouping = "State", color_by = "State")
p2 <- plot_genes_violin(mycds[s.genes,], grouping = "State", color_by = "State")
p3 <- plot_genes_in_pseudotime(mycds[s.genes,], color_by = "State")
plotc <- p1|p2|p3
ggsave("pseudotime/genes_visual.png", plot = plotc, width = 8, height = 4.5)

拟时相关基因聚类热图

Monocle中differentialGeneTest()函数可以按条件进行差异分析，将相关参数设为fullModelFormulaStr = "~sm.ns(Pseudotime)"时，可以找到与拟时相关的差异基因。我们可以按一定的条件筛选基因后进行差异分析，全部基因都输入会耗费比较长的时间。建议使用cluster差异基因或高变基因输入函数计算。分析结果主要依据qval区分差异的显著性，筛选之后可以用plot_pseudotime_heatmap函数绘制成热图。

#cluster差异基因
diff.genes <- read.csv('subcluster/diff_genes_wilcox.csv')
sig_diff.genes <- subset(diff.genes,p_val_adj<0.0001&abs(avg_logFC)>0.75)$gene
sig_diff.genes <- unique(as.character(sig_diff.genes))
diff_test <- differentialGeneTest(mycds[sig_diff.genes,], cores = 1, 
                              fullModelFormulaStr = "~sm.ns(Pseudotime)")
sig_gene_names <- row.names(subset(diff_test, qval < 0.01))
p1 = plot_pseudotime_heatmap(mycds[sig_gene_names,], num_clusters=3,
                             show_rownames=T, return_heatmap=T)
ggsave("pseudotime/pseudotime_heatmap1.png", plot = p1, width = 5, height = 8)
#高变基因
disp_table <- dispersionTable(mycds)
disp.genes <- subset(disp_table, mean_expression >= 0.5&dispersion_empirical >= 1*dispersion_fit)
disp.genes <- as.character(disp.genes$gene_id)
diff_test <- differentialGeneTest(mycds[disp.genes,], cores = 4, 
                              fullModelFormulaStr = "~sm.ns(Pseudotime)")
sig_gene_names <- row.names(subset(diff_test, qval < 1e-04))
p2 = plot_pseudotime_heatmap(mycds[sig_gene_names,], num_clusters=5,
                             show_rownames=T, return_heatmap=T)
ggsave("pseudotime/pseudotime_heatmap2.png", plot = p2, width = 5, height = 10)

BEAM分析

单细胞轨迹中通常包括分支，它们的出现是因为细胞的表达模式不同。当细胞做出命运选择时，或者遗传、化学或环境扰动时，就会表现出不同的基因表达模式。BEAM(Branched expression analysis modeling)是一种统计方法，用于寻找以依赖于分支的方式调控的基因。

disp_table <- dispersionTable(mycds)
disp.genes <- subset(disp_table, mean_expression >= 0.5&dispersion_empirical >= 1*dispersion_fit)
disp.genes <- as.character(disp.genes$gene_id)
mycds_sub <- mycds[disp.genes,]
plot_cell_trajectory(mycds_sub, color_by = "State")
beam_res <- BEAM(mycds_sub, branch_point = 1, cores = 8)
beam_res <- beam_res[order(beam_res$qval),]
beam_res <- beam_res[,c("gene_short_name", "pval", "qval")]
mycds_sub_beam <- mycds_sub[row.names(subset(beam_res, qval < 1e-4)),]
plot_genes_branched_heatmap(mycds_sub_beam,  branch_point = 1, num_clusters = 3, show_rownames = T)

获取帮助

本教程的目的在于把常用的单细胞分析流程串起来，适合有一定R语言基础的朋友参考。分析原理和代码我没有详细解释，官网有详细的教程和权威的解释，翻译好的中文教程也有多个版本，有兴趣的可以搜索一下。如果您学习本教程有一定困难，可以点击 “阅读原文” 找到作者联系方式，获取帮助。

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