转录组RNA-Seq使用docker+bioconda搭建分析环境

前言

近期学习转录组分析，从ncbi下载数据，转成fastq，STAR/hisat2 map到基因组上，使用featureCount拿到表达矩阵文件挺顺利的，就是到了下游分析，开始使用R开始遇到了各种问题。

原因是之前一直使用的一个docker 环境是基于ubuntu 16.04的，上面的R版本是3.2.3，在进行下游分析的时候各种R包安装不上，原因也是R版本太旧。经历了各种问题之后终于忍无可忍，决心重新构建一个RNA-Seq的docker分析环境，本文作为记录以备后查。

基于docker构建环境

笔者使用docker的方式属于网上不推荐的方式，类似于虚拟机镜像。原因就是懒得去编写dockerfile，感觉太麻烦。

极速安装docker

  #docker急速安装，快速完成不浪费时间
  # curl  -sSfL get.docker.io -o get_docker.sh
  # bash  get_docker.sh --mirror Aliyun

极速安装docker-compose

  #从以下网址下载docker-compose，将docker-compose文件放在path变量目录下如：/usr/local/bin
  https://github.com/docker/compose/releases

选择docker镜像并构建基础镜像

因为之前的Ubuntu16.04过于老旧，这里直接选择Ubuntu20.04的镜像

  #拉取ubuntu20.04镜像
  docker pull ubuntu:20.04
  
  #获取docker镜像列表
  docker images 或者 docker image ls
  
  #确认docker镜像拉取完成之后，使用该镜像创建一个docker容器
  docker run --name first -it ubuntu:20.04 /bin/bash
  
  #运行完成之后进入容器中
  root@80cb4d36be59#
  
  #安装ssh等软件
  root@80cb4d36be59# apt update && apt install openssh-server vim net-tools curl
  
  #安装完成之后修改ssh配置文件，便于远程登录
  root@80cb4d36be59# vim /etc/ssh/sshd_config
  
  #修改如下几行并保存
  Port 9020  #修改默认端口号(可选)
  ListenAddress 0.0.0.0  #默认监听地址，所有地址
  LoginGraceTime 2m      #允许用户登录耗时（可选）
  PermitRootLogin yes    #允许root用户登录，docker默认用户是root用户
  
  #修改默认root账户密码，便于ssh远程登录
  root@80cb4d36be59# passwd root
  
  #启动ssh服务
  root@80cb4d36be59# service ssh start
  
  # 获取容器ip地址，
  root@b8080a125313:/# ifconfig
  eth0: flags=4163<UP,BROADCAST,RUNNING,MULTICAST>  mtu 1500
          inet 172.17.0.2  netmask 255.255.0.0  broadcast 172.17.255.255
          ether 02:42:ac:11:00:02  txqueuelen 0  (Ethernet)
          RX packets 27095  bytes 55050990 (55.0 MB)
          RX errors 0  dropped 0  overruns 0  frame 0
          TX packets 26785  bytes 2478368 (2.4 MB)
          TX errors 0  dropped 0 overruns 0  carrier 0  collisions 0
  
  lo: flags=73<UP,LOOPBACK,RUNNING>  mtu 65536
          inet 127.0.0.1  netmask 255.0.0.0
          loop  txqueuelen 1000  (Local Loopback)
          RX packets 0  bytes 0 (0.0 B)
          RX errors 0  dropped 0  overruns 0  frame 0
          TX packets 0  bytes 0 (0.0 B)
          TX errors 0  dropped 0 overruns 0  carrier 0  collisions 0
  
  #打开一个新的终端测试下连接
  ssh root@172.17.0.2 -p9020
  
  #如果可以连接上则第一步构建完成，我们commit创建自己的镜像，打开终端
  docker commit first ubuntu20.04-ssh:1.00

第二阶段：安装bioconda构建基础生信镜像

退出并删除之前运行的容器

#退出之前的容器
root@80cb4d36be59# exit
#删除该容器
docker rm first

编写docker-compose.yml文件，并使用docker-compose启动容器

version: "3"
services:
  RNASeq:
    image: ubuntu20.04-ssh:1.00 #此处为我们之前提交的镜像名称
    container_name: rnaseq #运行容器名称
    volumes:
      - /media/sliver/Element1/data:/opt/data:rw  #外挂data目录，放置原始数据
      - /media/sliver/Manufacture/RNA-Seq/root:/root:rw #外挂root目录，bioconda安装位置，减小镜像体积
      - /media/sliver/Manufacture/RNA-Seq/ref:/opt/ref:rw #外挂reference目录
      - /media/sliver/Manufacture/RNA-Seq/result:/opt/result:rw #分析结果输出及中间文件目录
    ports:
      - "9020:9020"
    network_mode: "host" #此处直接使用host模式，默认为bridge模式都可以，host模式注意不能与服务器端口冲突
    environment:
      - TZ="Asia/Shanghai" #通过变量设置时区，否则系统时间错误
    command: service ssh start -D  #启动容器时启动ssh服务便于远程连接

使用docker-compose.yml文件启动容器

docker-compose.yml文件目录下运行docker-compose up启动容器
并查看输出日志，看是否存在错误

使用ssh登录镜像，并安装bioconda

#这里使用127.0.0.1地址登录，每次容器重新运行ip地址172网段的会发生变动
ssh root@127.0.0.1 -p9020

#登录成功,安装bioconda
curl -O https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
sh Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh

#setup channels
conda config --add channels defaults
conda config --add channels bioconda
conda config --add channels conda-forge

构建bioconda 第二阶段镜像

#测试没有问题，打开一个新的终端提交镜像，第二阶段镜像后续可以用于各种生信环境
docker commit rnaseq ubuntu20.04-bioconda

第三阶段，安装R、Bioconductor和RStudio-Server，构建用于RNA-Seq(转录组)的镜像

安装R及Bioconductor

#切换会刚才的容器内shell终端，安装R
apt install r-base

#安装完成之后查看版本
R --version
#得到输出如下：
R version 3.6.3 (2020-02-29) -- "Holding the Windsock"
Copyright (C) 2020 The R Foundation for Statistical Computing
Platform: x86_64-pc-linux-gnu (64-bit)

R is free software and comes with ABSOLUTELY NO WARRANTY.
You are welcome to redistribute it under the terms of the
GNU General Public License versions 2 or 3.
For more information about these matters see
https://www.gnu.org/licenses/.

#安装Bioconductor，终端中运行
R
#R环境提示符运行
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
    install.packages("BiocManager")
BiocManager::install()

#安装完成之后我们测试下，安装两个R包
BiocManager::install('edgeR')
BiocManager::install("DESeq2")

安装RStudio Server，为了远程部署和运行R

#安装RStudio Server
apt-get install gdebi-core
wget https://download2.rstudio.org/server/bionic/amd64/rstudio-server-1.3.1093-amd64.deb
gdebi rstudio-server-1.3.1093-amd64.deb

#创建配置文件
vi /etc/rstudio/rserver.conf
#添加如下语句
###在两个配置文件中添加以下语句
##系统的R程序所在位置，如果个人目录下有利用anaconda安装R，可能会报错
rsession-which-r=/usr/bin/R  
www-port=8787 ### 通过ip的8787端口连接


vi /etc/rstudio/rsession.conf
#添加如下语句
www-port=8787 ### 通过ip的8787端口连接

#添加用户sliver，用于登录RStudio Server
useradd sliver
passwd  sliver

#创建该用户home目录，否则登录成功，但是会报错 Unable to connect to service
mkdir /home/sliver
chown -R sliver /home/sliver

#检查Rstudio-server是否能够运行并启动服务启动
rstudio-server verify-installation
rstudio-server start

打开浏览器输入：http://127.0.0.1:8787

使用之前创建的用户sliver及密码登录：

说明配置成功。

提交镜像，并修改docker-compose.yml文件

提交镜像，用于RNA-Seq转录组分析

#打开一个新的终端运行
docker commit rnaseq ubuntu20.04-rnaseq:1.00

#将当前容器导出为文件
docker export -o ubuntu_20.04_rnaseq.tar rnaseq

#迁移镜像可以从文件导入至镜像
docker import ubuntu_20.04_rnaseq.tar ubuntu20.04-rnaseq:1.00

修改docker-compose.yml文件

version: "3"
services:
  RNASeq:
    image: ubuntu20.04-rnaseq:1.00
    container_name: rnaseq
    volumes:
      - /media/sliver/Element1/data:/opt/data:rw #挂载数据目录
      - /media/sliver/Manufacture/RNA-Seq/root:/root:rw #挂载root目录
      - /media/sliver/Manufacture/RNA-Seq/ref:/opt/ref:rw #挂载reference目录
      - /media/sliver/Manufacture/RNA-Seq/result:/opt/result:rw #挂载中间文件和结果目录
    ports:
      - "9020:9020"  # ssh连接端口
      - "8787:8787"  # RStudio Server Web访问端口
    network_mode: "host" #网络模式为host，注意端口与服务器端口不能冲突
    environment:
      - TZ="Asia/Shanghai" #设置时区，方式时间不对
    command: /bin/bash -c "rstudio-server start && service ssh start -D" #同时启动两个服务

docker镜像文件及root目录打包下载

docker镜像 ssh登录账户root 密码20201110; rstudio登录账户sliver密码20201110

docker-compose.yml文件下载