还是用RSeQC对比对后的转录组数据做一下质控

那个时候写教程，以软件安装，软件input和output为主，因为觉得新手最容易纠结的就是这些了，但是现在回过头来看，软件安装已经成了小菜一碟，对各种bam/sam/vcf/gtf也耳熟能详，所谓的input/output也不是问题了。

所以，再看看我最近是如何记录该软件的吧：

RSeQC包是一个python软件，最新版是 v2.6.4 ， 依赖于： gcc; python2.7; numpy; R

它提供了一系列有用的小工具能够评估高通量测序尤其是RNA-seq数据，比如一些基本模块，检查序列质量, 核酸组分偏性, PCR偏性, GC含量偏性,还有RNA-seq特异性模块: 评估测序饱和度， 映射读数分布， 覆盖均匀性， 链特异性， 转录水平RNA完整性等

详细列表如下：

bam2fq.py

bam2wig.py

bam_stat.py

clipping_profile.py

deletion_profile.py

divide_bam.py

FPKM_count.py

geneBody_coverage.py

geneBody_coverage2.py

infer_experiment.py

inner_distance.py

insertion_profile.py

junction_annotation.py

junction_saturation.py

mismatchprofile.pynormalizebigwig.pyoverlay_bigwig.py

read_distribution.py

read_duplication.py

readGC.pyreadhexamer.py

read_NVC.py

read_quality.py

RNAfragmentsize.py

RPKMcount.pyRPKMsaturation.py

spilt_bam.py

splitpairedbam.py

tin.py

数据库文件

RSeQC接受4种文件格式:

BED 格式: Tab 分割, 12列的表示基因模型的纯文本文件

SAM 或BAM 格式: 用来存储reads 比对结果信息.

染色体大小文件: 只有两列的纯文本文

Fasta文件的参考基因组

数据库文件根据参考基因组版本自行选择下载，我这里要下载的是hg19系列，下载地址如下：

希望读者能够明白，看教程一定要看规律，我为什么列出如此多的url，其实就是想你领悟它们的共性： 你在浏览器打开就明白了。

### 软件安装

虽然该软件的使用命令非常多，但很多功能并不是用来诊断转录组测序的，所以不在我们的考虑范围内。下面是我们经常会用得到的：

用 来统计总比对记录, , 表示多匹配位点, , , , 等.

可以看到比对效果非常赞，这个转录组很成功！

另外一个比较赞的小程序就是： 结果一般如下：

可以用一个饼图来表示，在生信技能树论坛里面还有人专门提问过。

用 来计算RNA-seq 在基因上的覆盖度，这里推荐对所有的样本的 文件一起运行该程序进行诊断，如图：

junction_annotation.py:

输入一个 或 文件和一个 格式的参考基因文件,这个模块将根据参考基因模型计算剪切融合(splice junctions)事件.

splice read: 一个RNA read,能够被剪切一次或多次

splice junction:多个跨越同一个内含子的剪切事件能够合并为一个 .

一般来说，novel的junction区域总是有的，因为我们用的是ucsc的refseq参考注释集，本身就是不够完整的。

RPKM_saturation.py

  任何样本统计（ ）的精度受样本大小（ ）的影响，重抽样或切片是使用部分数据来评估样本统计量的精度的方法。这个模块从总的 中重抽样并计算每次的 值，通过这样我们就能检测当前测序深度是不是够的(如果测序深度不够RPKM的值将不稳定,如果测序深度足够则RPKM值将稳定)。*默认情况下,这个模块将计算20个 值(分别是对个转录本使用5%,10%,…,95%的总 )，所以非常消耗内存哦。

  在结果图中,Y轴表示 或

说明:Q1,Q2,Q3,Q4是按照转录本表达量4分位分开的.Q1表示的是表达量低于25%的转录本,以此类推.可以看出:随着样本量升高, 与实际值的偏差也在降低.而且转录本表达量越高这种趋势越明显(Q4最明显).

写在最后：

NGS组学分析流程的每一个步骤都应该是有充分的质量控制，主要是考虑到各个项目的实际情况可能会比较特殊，如果都走一样的自动化，流水线的流程，肯定是会有问题的。

明天给大家看看，问题主要是什么，敬请期待哈。